摘 要  文章綜述了目前國際上免疫分析中應(yīng)用的(金鋼烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物的結(jié)構(gòu)、發(fā)光機(jī)理、發(fā)光性能和特點(diǎn)以及其免疫分析體系。

關(guān)鍵詞 AMPPD，(金鋼烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物，化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)，發(fā)光機(jī)理，發(fā)光性能

     目前，在免疫分析領(lǐng)域中應(yīng)用多種免疫分析方法，其中化學(xué)發(fā)光免疫分析 (CLIA)是將免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)相結(jié)合,藉以檢測抗原或抗體的技術(shù)。它是將發(fā)光物質(zhì)或酶標(biāo)記在抗原或抗體上，免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入氧化劑或酶底物而發(fā)光，通過測量發(fā)射光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測物的濃度。CLIA的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、標(biāo)記物有效期長、檢測范圍寬，可實(shí)現(xiàn)全自動化等。CLIA具有強(qiáng)大的生命力，在國際和國內(nèi)倍受臨床用戶和生物醫(yī)學(xué)工作者的重視。近十年來 CLIA 的發(fā)展迅猛，國外已開發(fā)出多種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，CLI 2A 系統(tǒng)，以及全自動化化學(xué)發(fā)光儀。不同的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)光機(jī)理和發(fā)光性能不同，不同的 CLIA 系統(tǒng)原理和方法各異。在眾多的化學(xué)發(fā)光分子當(dāng)中，1，2-二氧雜環(huán)類是發(fā)光效率較高的一類AMPPD 3-( 2-螺旋金剛烷) -4-甲氧基-4-( 3-磷氧酰) -苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷作為1，2-二氧雜環(huán)中具代表性的化學(xué)發(fā)光分子它的化學(xué)發(fā)光性質(zhì)一直是人們研究的熱點(diǎn)。本文綜述了目前國際上免疫分析中應(yīng)用的幾種( 金鋼烷) - 1 , 2 - 二氧乙烷類及其免疫分析體系。

    (金鋼烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物能發(fā)生化學(xué)發(fā)光的(金鋼烷)-1,2-二氧乙烷,其結(jié)構(gòu)可以表示如下通式:
 

　　其中T通常為環(huán)烷烴金鋼烷，起穩(wěn)定過氧環(huán)的作用，X為烷氧基，它的作用是增加2-二氧乙烷的水溶性，Y是發(fā)光基團(tuán)(也叫生色基團(tuán)和熒光發(fā)色團(tuán))，Z是 Y的保護(hù)基團(tuán)，它與Y連接的化學(xué)鍵能被堿性磷酸酶斷裂，而使Z與Y脫離。當(dāng)酶促使Z從分子中脫離后，二氧乙烷分解成兩個羰基化合物，一個含T，另一個含X和Y，分解反應(yīng)放出的能量，使Y激發(fā)形成一不穩(wěn)定的電子激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時發(fā)出光子。可以通過選擇修飾不同取代基Y的二氧乙烷，使發(fā)射光的波長和光量子數(shù)不同，而通過選擇修飾T和X、Z可改變二氧乙烷的水溶性和分解動力學(xué)性質(zhì)。

    常用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的(金鋼烷)-1,2-二氧乙烷有下面幾種結(jié)構(gòu): 

在上述分子結(jié)構(gòu)中，螺旋金剛烷構(gòu)成分子的穩(wěn)定部分，帶有保護(hù)基團(tuán)(磷酸酯或半乳糖吡喃苷)的衍生芳香族結(jié)構(gòu)，則構(gòu)成易被酶解并在酶解后發(fā)光的部分，發(fā)光由二氧乙烷斷裂分解成為一個激發(fā)態(tài)的兩個羰基化合物。例如AMPPD在堿性磷酸酶(AP)作用下磷酸酯基發(fā)生水解，脫去一個磷酸基而得到一個中等穩(wěn)定的中間體AMPPD-(半衰期2-30min)，此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金鋼烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當(dāng)回到基態(tài)時發(fā)出波長為470nm的光，并可持續(xù)幾十分鐘，其發(fā)光機(jī)理如下圖所示:

 

　　AMPPD的特性：(1)在堿性環(huán)境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；(2)AMPPD的熱穩(wěn)定性好，在pH=7.0的水中，30℃時的分解半衰期為142h ,活化能為21.5kcal/mole；(3)在pH =9.0時，AP酶解AMPPD的速度快；在pH =9.5時，雖酶解速度略低，但信噪比低；(4)AMPPD的酶解發(fā)光為輝光型，波長為470nm，在15min時強(qiáng)度達(dá)到高峰，15- 60min內(nèi)光信號強(qiáng)度維持一致，變化很小，即使在12h后

仍能測定得出正確結(jié)果；(5)加入增強(qiáng)劑如聚氯芐乙烯芐基二甲基銨(BDMQ)或BSA等，能明顯增強(qiáng)AP酶解AMPPD的發(fā)光強(qiáng)度，增強(qiáng)因素達(dá)100-100000倍。增強(qiáng)劑的增強(qiáng)機(jī)理目前還不非常清楚，在理論上還沒有精確的解釋，文獻(xiàn)上一般認(rèn)為AMPPD在中等極化的非質(zhì)子有機(jī)溶劑(如正丁醇，二甲基亞砜等)中的發(fā)光強(qiáng)度和檢測靈敏度較在極化的質(zhì)子溶劑中，尤其是水介質(zhì)中高。如在水介質(zhì)中加入增強(qiáng)劑，增強(qiáng)劑包圍在 AMPPD 分子的周圍，可能通過疏水或離子相互作用或二者兼而有之，與 AMPPD 酶解產(chǎn)生的發(fā)色團(tuán)結(jié)合，使發(fā)色團(tuán)形成一個穩(wěn)定的構(gòu)。這樣使發(fā)色團(tuán)與水分子隔開，從而阻止發(fā)色團(tuán)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，非光發(fā)射的途徑如振動松馳以熱能的形式釋放全部或部分能量，一些天然的水溶性大分子如水溶性球蛋白BSA、HAS等，和人工合成的聚季銨鹽如 TMQ、BDMQ 等，它們的分子結(jié)構(gòu)中都含有疏水區(qū)，能提供一個疏水性微環(huán)境，具有穩(wěn)定

發(fā)色基團(tuán)的作用，從而增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度。

CSPD和CDP-Star是繼AMPPD后合成的AP酶解化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，它們的發(fā)光性能優(yōu)于AMPPD:CSPD和CDP - Star較AMPPD穩(wěn)定；非酶解性的水解程度更低； 酶解速度更快，達(dá)到最大光信號只需要相當(dāng)于AMPPD時間的一半；且發(fā)光信號更強(qiáng)，信噪比更高；CSPD和CDP-Star是理想的AP 酶解化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。

(金鋼烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物應(yīng)用于CLIA，通常采用的體系是 Dioxetane/ AP/ En 2hance System ，即用堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記抗原或抗體，用 (金鋼烷)-1,2-二氧乙烷或其衍生物作發(fā)光底物，在發(fā)光底物中加入增強(qiáng)劑。目前美國DPC公司的Immulite System 和Beckman Coulter公司ACCESSòAutomated Immunoassay System 都是采用Dioxetane/ AP/ Enhance System。