產(chǎn)品簡介

檢測糞便中病原菌等微生物、以及一些未消化食物樣品的RNA是現(xiàn)代診斷的重要手段。由于糞便中存在大量抑制因子，常規(guī)的RNA純化方式不能有效地去除這些雜質(zhì)，導(dǎo)致下游實(shí)驗(yàn)的失敗，如PCR不能擴(kuò)增出所需片段。Stool RNA Kit采用了簡便的硅膠柱純化方式和獨(dú)特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動物糞便中各種影響下游實(shí)驗(yàn)抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。一次可處理0.05-0.5g樣品，純化的DNA可直接用PCR等實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成

儲存和穩(wěn)定性

室溫保存，一年有效。Buffer RC2與Buffer RC3可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

請詳細(xì)閱讀該手冊并熟悉各個步驟，在開始之前準(zhǔn)備好所有的試劑盒組分和必需的器材。

試劑準(zhǔn)備：

縮的RNA Wash Buffer II 需用無水乙醇按如下稀釋：

R1301 加8 ml；R1305加入52 ml ；R1306與R1307每瓶加入104 ml 無水乙醇

Buffer RC1使用前加入終濃度為1%的巰基乙醇，如1ml Buffer RC1加入10μl巰基乙醇。

需自備器材

無水乙醇    1.5ml離心管    水浴    離心機(jī)

操作步驟

1. 稱0.3-0.5g糞便置于2ml離心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入500μl Buffer RC1（注意加入5μl巰基乙醇） ，100μl Buffer RC2以及500μl水飽和酚（需自備）。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意：對含水量豐富的樣品，可以預(yù)先離心除去部分水分后再稱去樣品。Buffer RC2是我司獨(dú)特的腐殖酸除去劑，100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， Buffer RC2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過250μl，否則會嚴(yán)重影響RNA的得率。

2. 加入200μl Buffer RC3（RC3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋5-10分鐘。

3. 加入200μl氯仿渦旋。12000 rpm(~13000×g)離心5鐘，轉(zhuǎn)600μl上清到1.5ml離心管中，加入180μl Buffer RC4混勻。

注意：轉(zhuǎn)移上清時確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過80%。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心5鐘。 轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中。

5. 加入二分之一上清體積的 Buffer RC5與與等體積的無水乙醇，充分混勻。如：向500μl 上清中加入250μl Buffer C3與500μl無水乙醇。

6. 把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到GBC分離柱上。10,000×g離心30秒以結(jié)合RNA，棄去濾出液體。

純化柱最大容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱。

7. 向GBC吸附柱中加入500μl Wash Buffer I 離心30秒，棄廢液。

8. 向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，GBC吸附柱放入收集管中。

注意：Wash Buffer II使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）

9.向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。

10. 12,000 rpm(~13,400×g)離心1分鐘，倒掉廢液，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

11. 將GBC吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加30-100μl RNase-free Water，室溫放置2 分鐘，4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)離心1分鐘。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30μl，體積過小影響回收效率。且RNA 應(yīng)保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA 得率，可重復(fù)上步操作一次，合并兩次得到的溶液。