免疫組化操作步驟
免疫組化操作規(guī)程
一儀器設(shè)備
118cm不銹鋼高壓鍋和電爐2醫(yī)用微波爐3水浴箱; 4冰箱-18-45濕盒6耐高溫塑料切片架7可調(diào)微量移液器8定時器9pH計
二試劑
1PBS(磷酸鹽緩沖液pH7.27.4)NaCl 137mmol/LKCl 2.7mmol/LNa2HPO4 4.3mmol/LKH2PO4 1.4mmol/L
2檸檬酸鹽緩沖液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制檸檬酸三鈉 3g檸檬酸 0.4g
3酶消化液 a0.1%胰蛋白酶液用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制 b0.4%胃蛋白酶液用0.1N的HCl配制
三操作流程
1 脫蠟和水化
脫蠟前將組織芯片放在60恒溫箱中烘烤30分鐘
1置于二甲苯I中浸泡10分鐘在二甲苯II中再浸泡10分鐘
2無水乙醇I中浸泡5分鐘在無水乙醇II中再浸泡5分鐘
395%乙醇中浸泡5分鐘
485%乙醇中浸泡5分鐘
570%乙醇中浸泡5分鐘
6蒸餾水中浸泡5分鐘
2抗原修復(fù)
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片
1抗原熱修復(fù)
A 高溫高壓熱修復(fù) 取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0于壓力鍋中大火加熱至沸騰將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上放入已沸騰的緩沖液中蓋上鍋蓋扣上壓力閥繼續(xù)加熱至噴氣從噴氣開始計時1-2分鐘后壓力鍋離開熱源冷卻至室溫取出玻片先用蒸餾水洗兩次后用PBS洗5分鐘
B微波熱修復(fù)取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0于微波盒中微波加熱至沸騰將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上放入已沸騰的緩沖液中中高檔繼續(xù)處理10-15分鐘取出微波盒冷卻至室溫取出玻片先用蒸餾水洗兩次后用PBS洗5分鐘
C酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37切片也預(yù)熱至37消化時間約為5~30分鐘胃蛋白酶消化37時間為10-30分鐘
3免疫組織化學染色
SP法
1脫蠟水化
2蒸餾水中5分鐘
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10分鐘蒸餾水洗1次
4抗原修復(fù)
5PBS洗5分鐘
6滴加正常山羊血清封閉液,室溫10分鐘
7甩去多余液體滴加抗371小時或者4過夜4過夜后在37復(fù)溫45分鐘
8PBS洗2次各5分鐘
9滴加生物素化抗孵育條件參見所用試劑盒
10PBS洗2次各5分鐘
11滴加酶標抗體孵育條件參見所用試劑盒
12PBS洗2次各5分鐘
13DAB顯色510分鐘在顯微鏡下掌握染色程度
14蒸餾水洗終止染色蘇木素復(fù)染鹽酸酒精分化
15脫水透明封片鏡檢
SABC法
1脫蠟水化
2蒸餾水中5分鐘
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉510分鐘蒸餾水洗1次
4抗原修復(fù)
5PBS洗5分鐘
6滴加正常山羊血清封閉液室溫10-20分鐘甩去多余液體
7滴加抗,371小時或者4過夜4過夜后在37復(fù)溫30分鐘
8PBS洗2次每次5分鐘
9滴加生物素化二抗孵育條件參見所用試劑盒
10PBC洗2次每次5分鐘
11滴加試劑SABC孵育條件參見所用試劑盒
12PBS洗2次每次5分鐘
13DAB顯色DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色鏡下掌握顯色程度
14蒸餾水洗終止染色蘇木素復(fù)染鹽酸酒精分化
15脫水透明封片鏡檢
試劑推薦：
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英文名 |
中文名 |
規(guī)格/價格 |
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SP Kit (Broad Spectrum). |
免疫組化檢測試劑盒（通用型廣譜是指;可用于檢測兔、大鼠、小鼠和豚鼠來源的一抗） |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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SP Kit (Rabbit) |
免疫組化檢測試劑盒(兔) |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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SP Kit (Mouse) |
免疫組化檢測試劑盒(小鼠) |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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Double Staining Kit (Mo/HRP+Rb/AP) |
免疫組化雙染檢測試劑盒(鼠/兔一抗) |
6ml/1860 |
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DAB kit |
二氨基聯(lián)苯胺/DAB染色試劑盒（25倍稀釋） |
1ml/90 |
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DAPI |
DAPI染色液(細胞核染色液) |
10ml/90 30ml/220 |
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Goat serum |
封閉用正常山羊血清（原液） |
5ml/25 10ml/40 |
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Rabbit serum |
封閉用正常兔血清（原液） |
5ml/25 10ml/45 |
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mouse serum |
封閉用正常小鼠血清（原液） |
5ml/35 |
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IHC Antibody Diluent |
免疫組化抗體稀釋液 |
100ml/120 |
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DAB |
DAB顯色劑（SIGMA分裝） |
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Trypsin Induced Antigen Retrieval Solution |
胰蛋白酶抗原修復(fù)液 |
3ml/180 10ml/348 |
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胰蛋白酶抗原修復(fù)液（含使用方法說明） |
10ml/348 |
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Citrate buffer( |
檸檬酸鹽緩沖液（ |
1000ml/袋/4 2000ml/袋/8 |
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Citrate buffer( |
抗原熱修復(fù)試劑(100×濃縮液) |
70ml/90 |
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Poly-L-Lysine Solution(10×) |
多聚賴氨酸(10×防脫片劑) |
5ml/110 10ml/200 100ml/1600 |
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Poly-L-Lysine |
多聚賴氨酸(防脫片劑) |
25mg/460 50mg/750 100mg/1300 |
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poly-L-lysine-Prep Slides |
多聚賴氨酸防脫磨砂玻片 |
50片/100 |
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Glass slides |
載玻片 |
50片/40 |
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防脫片液(硫酸鉻鉀-明膠黏片劑粉劑) |
200ml/50 500ml/100 |
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HE Staining Kit |
蘇木素-伊紅染色試劑盒 |
50ml/500片/180 |
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APES |
APES防脫片試劑 |
10ml/85 |
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Citrate buffer powders( |
檸檬酸鹽緩沖液(抗原熱修復(fù)試劑)（ |
1000ml/pouch/4 |
|
Citrate buffer( |
檸檬酸鹽緩沖液 （ |
500ml/袋/200 |
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Permount TM Mounting Medium |
中性樹膠封片劑 |
100ml/150 |
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PBS, powder, ( |
磷酸鹽緩沖液( |
1000ml/pouch/4 2000ml/pouch/8 |
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Triton X-100 |
聚乙二醇辛基苯基醚 |
100ml/40 |
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Tris |
三羥甲基氨基甲烷 |
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Tween 20 |
吐溫20 |
100ml/40 |
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