手 工 提 取 流 程

1.   樣品的處理：

●   新鮮樣品：

液氮研磨：新鮮樣品可以用液氮研磨成粉末。研磨完成后，取小于100mg新鮮樣品或者小于20mg干燥樣品，加入600μl Buffer FPL與4μl RNase A渦旋混勻。（Buffer FPL與RNase A可以根據(jù)樣品量預(yù)先混勻）。

珠磨儀：在2ml的離心管中加入1顆4mm的不銹鋼珠（需單獨(dú)購買）、600μl BufferFPL與4μl RNase A。加入小于100mg新鮮樣品或者小于20mg干燥樣品，葉片等易磨樣品按65Hz，90s研磨一次。豆粒等難磨樣品按65Hz，120s研磨2次。豆粒等要預(yù)先搗碎，直徑不超3mm研磨效果更佳。

●   干燥樣品：用研缽或研磨研杵研磨成粉末。小于20mg干燥樣品，加入600μl Buffer FPL與4μl RNase A渦旋混勻。

2.    65℃水浴10分鐘。孵育過程中短暫渦旋管子幾次。

     注意：珠磨儀研磨的樣品，可以不用水浴直接進(jìn)下下一步操作。

3.       14,000×g下離心5-10min。

4.       轉(zhuǎn)移300µl上清到新的離心管中加入600 µl Buffer MB（第一次使用前加入異丙醇）和20µl MagIso Beads，混勻。靜置2-4分鐘。

5.       將離心管放置于磁力架上靜置1-2min，待磁珠完全吸附時小心去除液體。

6.       加入600μl Buffer MW1（第一次使用前加入無水乙醇），蓋上離心管渦旋15s，放回磁力架，離心管與磁力架一起顛倒3-4次，磁吸1min，吸棄所有液體（包括管蓋中殘留的）。

7.       加入600μl Wash Buffer（第一次使用前加入無水乙醇），蓋上離心管渦旋15s，放回磁力架，離心管與磁力架一起顛倒3-4次，磁吸1min，吸棄所有液體（包括管蓋中殘留的）。

8.       重復(fù)上一步操作步一次。

9.       空氣干燥2-5分鐘。 干燥不能太長時間，否則會影響洗脫。

10.     加50~100µl 預(yù)熱至55^oC的Buffer TE或滅菌水等緩沖液，渦旋打散磁珠。靜置3~5分鐘，其間輕輕振蕩1~2次加速DNA溶解。

11.    轉(zhuǎn)移至磁力架上，靜置1-2分鐘。轉(zhuǎn)移DNA溶液至新的1.5ml離心管中。