R1301 加8 ml；R1305加入52 ml ；R1306與R1307每瓶加入104 ml 無(wú)水乙醇

Buffer RC1使用前加入終濃度為1%的巰基乙醇，如1ml Buffer RC1加入10μl巰基乙醇。

需自備器材

無(wú)水乙醇    1.5ml離心管    水浴    離心機(jī)

操作步驟

1. 稱(chēng)0.3-0.5g糞便置于2ml離心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入500μl Buffer RC1（注意加入5μl巰基乙醇） ，100μl Buffer RC2以及500μl水飽和酚（需自備）。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意：對(duì)含水量豐富的樣品，可以預(yù)先離心除去部分水分后再稱(chēng)去樣品。Buffer RC2是我司獨(dú)特的腐殖酸除去劑，100μl對(duì)大部分樣品來(lái)說(shuō)足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對(duì)一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， Buffer RC2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過(guò)250μl，否則會(huì)嚴(yán)重影響RNA的得率。

2. 加入200μl Buffer RC3（RC3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋5-10分鐘。

3. 加入200μl氯仿渦旋。12000 rpm(~13000×g)離心5鐘，轉(zhuǎn)600μl上清到1.5ml離心管中，加入180μl Buffer RC4混勻。

注意：轉(zhuǎn)移上清時(shí)確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過(guò)80%。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心5鐘。 轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中。

5. 加入二分之一上清體積的 Buffer RC5與與等體積的無(wú)水乙醇，充分混勻。如：向500μl 上清中加入250μl Buffer C3與500μl無(wú)水乙醇。

6. 把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到GBC分離柱上。10,000×g離心30秒以結(jié)合RNA，棄去濾出液體。

純化柱最大容量為750μl,如果混合液大于750μl,請(qǐng)分兩次過(guò)柱。

7. 向GBC吸附柱中加入500μl Wash Buffer I 離心30秒，棄廢液。

8. 向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，GBC吸附柱放入收集管中。

注意：Wash Buffer II使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇）

9.向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。

10. 12,000 rpm(~13,400×g)離心1分鐘，倒掉廢液，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

11. 將GBC吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加30-100μl RNase-free Water，室溫放置2 分鐘，4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)離心1分鐘。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30μl，體積過(guò)小影響回收效率。且RNA 應(yīng)保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA 得率，可重復(fù)上步操作一次，合并兩次得到的溶液。