產(chǎn)品簡介

Water RNA Kit提供了從各種來源的水體樣品中快速簡便的提取基因組RNA的方法。水體樣品中存在大量微生物，這些微生物被作為重要的生態(tài)指示劑被廣泛應(yīng)用。從水體中提取高純度的基因組RNA是水體環(huán)境值檢測非常重要的手段。水體樣品中含有大量的抑制因子如腐殖酸、金屬離子等，這些物質(zhì)即使微量存在于純化后的RNA中也會對下游反應(yīng)產(chǎn)生影響，如對PCR、限制性酶切等。因而純化水體RNA的關(guān)鍵在于如何有效的去除水體中的抑制因子。

試劑盒組成

儲存和穩(wěn)定性

室溫保存，一年有效。Buffer RC2與Buffer RC3可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

請?jiān)敿?xì)閱讀該手冊并熟悉各個(gè)步驟，在開始之前準(zhǔn)備好所有的試劑盒組分和必需的器材。

濃縮的RNA Wash Buffer需用無水乙醇按如下稀釋：

R1801 加16 ml；R1805加入52 ml ；R1806與R1807每瓶加入104 ml 無水乙醇

濃縮的Buffer RC5需用異丙醇按如下稀釋：

R1801 加7ml；R1805加入35ml ；R1806與R1807每瓶加入63ml異丙醇

濃縮的Buffer WB需用無水乙醇按如下稀釋：

l   R1801 加6 ml；R1805加入14ml ；R1806加入28ml，R1807加入56ml 無水乙醇

標(biāo)準(zhǔn)操作步驟

1.       使用直徑為47mm，孔徑為0.22-0.45μm的濾膜對水體樣品進(jìn)行過濾，過濾體積取決于水體樣品的濁度和微生物的含量。用剪刀將1/2張或整張過濾后的濾膜盡量剪碎，置于2ml離心管中，以便于后面的裂解步驟。

2.      加入0.4g Glass Beads，再加入1.2ml Buffer RC1與50μl Buffer RC2。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意： Buffer RC2是我司獨(dú)特的腐殖酸除去劑，50μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， Buffer RC2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過150μl，否則會嚴(yán)重影響RNA的得率。

2. 加入250μl Buffer RC3（C3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋1-2min。70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。

注意：如果要純化革蘭氏陽性菌的RNA，請?jiān)?0℃處理完后，再90℃水浴處理2min。

3. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘，轉(zhuǎn)1ml上清到1.5ml離心管中，加入200μl BufferC4混勻。

注意：轉(zhuǎn)移上清時(shí)確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過80%。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心1鐘。 轉(zhuǎn)移上清到新的2.0ml離心管中。

注意：轉(zhuǎn)移上清時(shí)確保不要吸取到沉淀，轉(zhuǎn)移的上清量最好不超過80%。

5.加入與上清等體積 Buffer RC5（使用前請先檢查是否已加入異丙醇），混勻。

注意：Buffer WB使用前須按要求用無水乙醇稀釋。如果放入冰箱中，使用前須恢復(fù)到室溫。

6.取750μl混合液加到GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30秒，倒掉濾過液。

7. 重復(fù)第六步，將剩余的混合液過GBC吸附柱。

8. 向GBC吸附柱中加入500μl Buffer WB，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液。

9. 向GBC吸附柱 中加入600μl RNA Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，GBC吸附柱放入收集管中。

10. 向GBC吸附柱 中加入600μlRNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。

11. 12,000 rpm(~13,000×g)離心2 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

12. 將GBC吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100μl洗脫緩沖液TE或滅菌去離子水,室溫放置2min。

13. 室溫下，離心(>13.000)1min，以洗脫RNA。保留含RNA的流出液。